Как провести окрашивание по граму. Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты Техника окрашивания по граму

Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70-80 °С).

Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт , ацетон , смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания мазков

1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном , наливая и сливая его, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Окраска по Граму

Овчаровой Анны Игоревны

студентки 3 курса,

специальность «Биология»

Минск, 2016

Введение

1. Техника проведения окраски

1.1 Подготовка материала для окраски

1.2 Фиксация

1.2.1 Физический способ фиксации

1.2.2 Химический способ фиксации

1.3 Процесс окрашивания мазков

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

2.1 Модификация Hucker

2.2 Модификация Burke

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

2.4 Модификация Preston-Morrell

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ВВЕДЕНИЕ

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс.

При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки. Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000.

Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак (биологический сигнал). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов, вырабатываемых Clostridium difficile .

Окраску по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ, синовиальной, плевральной и перитонеальной жидкости. Нижний предел чувствительности метода составляет 10000 бактерий на 1 мл.

Чтобы увеличить чувствительность, исследуемую жидкость центрифугируют и готовят окрашенный мазок осадка. Эта процедура называется обогащением материала. Она проста и особенно ценна для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ и кислотоустойчивых бактерий в мокроте.

1. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ОКРАСКИ

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой -- дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (?) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легкоразрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

1.1 Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

1.2 Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваютсялучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

1.2.1 Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксациидолжен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметногостекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стеклодолжно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70--80 °С).

1.2.2 Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % -- 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10--15 минут и затем высушивают на воздухе.

1.3 Процесс окрашивания мазков

1 На фиксированный мазок наливают один из осномвных красителей на 2 или 3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

1. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1--2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1--2 минуты до почернения препарата.

2. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20--40--60 секунд).

3. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1--2 мин.

4. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2--5 мин).

5. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.

2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.

5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.

6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.

7. Промокают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 -- 2 мл); растворы сливаютдо тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.

9. Проводят через 3 смены ксилола

10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

2.1 Модификация Hucker

гистологический окрашивание бактерия

2.2 Модификация Burke

2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b (2-3 мин).

4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить).

7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек).

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют.

2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более).

3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).

4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать.

5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).

6. Препарат высушить на воздухе.

7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин).

8. Промыть и подсушить препарат.

2.4 Модификация Preston-Morrell

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин).

2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).

3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).

4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить.

5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить.

6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек).

7. Промыть и подсушить препарат.

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы

Особенности строения клеток бактерий, постоянные и непостоянные компоненты бактериальной клетки и принципы их окраски по Граму. Пропионово-кислое брожение и способы питания микроорганизмов. Санитарная оценка масла по микробиологическим показателям.

контрольная работа , добавлен 21.10.2010


Определение назначения и описание механизма гистохимических методов идентификации химических веществ в гистологических срезах. Описание электронной, люминесцентной и ультрафиолетовой микроскопии. Радиоавтография и культура клеток и тканей вне организма.

реферат , добавлен 09.09.2014


Техника приготовления гистологических препаратов для световой микроскопии, основные этапы данного процесса и требования к условиям его реализации. Методы исследования в гистологии и цитологии. Примерная схема окраски препаратов гематоксилин – эозином.

контрольная работа , добавлен 08.10.2013


История систематического изучения закономерностей эволюции тканей. Теория параллелизма гистологических структур. Теория дивергентной эволюции тканей. Теория филэмбриогенеза в гистологии. Эпителиальная, производные мезенхимы, мышечная и нервная ткань.

презентация , добавлен 12.11.2015


Слоистые каменные структуры (строматолиты) - результат жизнедеятельности бактерий как древнейшей группы организмов. Изучение бактерий, форма и строение бактерий, их размеры и распространение. Классификация бактерий по способу питания, размножение.

презентация , добавлен 14.10.2011


Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.

презентация , добавлен 23.02.2016


Разделение водорослей на систематические группы высшего ранга, его совпадение с характером окраски и чертами строения. Клеточные оболочки водорослей. Бесполое и половое размножение водорослей. Черты сходства и различия желто-зеленых и зеленых водорослей.

реферат , добавлен 09.06.2011


Питание бактерий. Способы поступления питательных веществ в клетку. Классификация бактерий по типам питания, источникам энергии и электронам. Пропионовокислое брожение, его основные участники, их характеристика, использование в народном хозяйстве.

контрольная работа , добавлен 29.11.2010


История и общая характеристика группы, описание ее пород, отличительные особенности и свойства. Окраска собак и принципы ее наследования. Особенности генетики окрасов и других селекционно-важных признаков собак группы "Буль", психические особенности.

дипломная работа , добавлен 20.04.2012


Понятие и механизм функционирования вкусовой сенсорной системы (вкусовой анализатор, орган вкуса). Трансдукция вкусового сигнала и основные нарушения. Обобщение повреждающих агентов. Усовершенствование метода окраска метиленовым синим вкусовых клеток.

Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт , ацетон , смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40 % формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40 % формалина в течение нескольких секунд.

Процесс окрашивания мазков

1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном , наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола.
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

См. также

Ссылки

На немецком языке

• Gram, HC (1884). «Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten». Fortschritte der Medizin 2 : 185-89.

На английском языке

• Bergey David H. Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology. - 9th ed.. - Lippincott Williams & Wilkins, 1994. - ISBN ISBN 0-683-00603-7
• Madigan MT Brock Biology of Microorganisms. - 10th Edition. - Lippincott Williams & Wilkins, 2004. - ISBN ISBN 0-130-66271-2
• Ryan KJ Sherris Medical Microbiology. - 4th ed.. - McGraw Hill., 2004. - ISBN ISBN 0-838-58529-9
• Application of stains in clinical microbiology - резюме статьи в Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119-125(7)

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Метод Грама" в других словарях:

ГРАМА МЕТОД - ГРАМА МЕТОД, предложенный Грамом в 1884 году и получивший широкое распространение метод окраски определенных видов бактерий, состоящий в том, что препарат перекрашивается розанилиновой краской (Methylviolett, Krystallviolett, Gentian violett,… … Большая медицинская энциклопедия

Метод дифференцированной окраски бактерий, при к ром одни бактерии окрашиваются в темно фиолетовый цвет (грамположительные бактерии, см.), др. в красный или розовый (грамотрицателъные бактерии,см.). Сущность метода состоит в том, что клеточная… … Словарь микробиологии

- (правило Крамера) способ решения квадратных систем линейных алгебраических уравнений с ненулевым определителем основной матрицы (причём для таких уравнений решение существует и единственно). Назван по имени Габриэля Крамера (1704–1752),… … Википедия

ГРАМА МЕТОД - (по имени дат. врача X. К. Грама, H. Ch. Gram, предложен в 1884), дифференциальная окраска бактерий. Применяется для окраски бактерий в мазках из культур, экссудатов, тканей и др. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 1% ным раствором… … Ветеринарный энциклопедический словарь

- (Н. Ch. J. Gram, 1853 1938, датский бактериолог, фармаколог и врач) дифференциально диагностический метод окраски бактерий путем последовательной обработки фиксированного мазка красителями трифенилметановой группы (генциановым фиолетовым и др.),… … Большой медицинский словарь

Предложенный в 1884 датским врачом Х. К. Грамом (Н. Ch. Gram) метод дифференциальной окраски бактерий. По Г. м. бактерии окрашивают основными красителями генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода … Большая советская энциклопедия

Метод решения системы линейных алгебраич. уравнений Ах=b с невырожденной матрицей А, основанный на процессе Грама Шмидта ортогонализации системы векторов. Если то исходная система уравнений может быть записана в виде (ai,y)=0, i = l, 2, ..., n.… … Математическая энциклопедия

ОКРАШИВАНИЕ ГРАМА, в микробиологии метод контрастного окрашивания, названный по имени датского врача Ганса Кристиана Грама (1853 1938). Он помогает при распределении по категориям и распознавании БАКТЕРИЙ, которые считаются грам положительными и… … Научно-технический энциклопедический словарь

Метод Грама метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом. По Граму бактерии окрашивают основными… … Википедия

6.Раствор Люголя. 2г KJ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и в этот раствор добавляют 1 г йода. Для ускорения растворения эту смесь растирают в фарфоровой ступке, после чего доливают водой до 300 мл. Используется при окраске бактерий по Граму.

Растворы красителей после изготовления фильтруют, разливают в склянки с притертыми пробками и сохраняют в темном месте. Для повседневной работы краски разливают в капельницы с притертыми пробками. Следует учитывать, что при длительном хранении растворов кристаллы краски могут выпадать в осадок, поэтому препарат рекомендуется окрашивать через полоску фильтровальной бумаги.

В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробных клеток.

При простой окраске на фиксированный мазок наносят раствор какого-либо одного красителя, например, разведенного фуксина, который интенсивно окрашивает вегетативные клетки бактерий.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя или большим количеством красок.

Окраска по Граму

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (пред ложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознаватель-ных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристаллвиолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грамм+). Например, роды спорообразующих бактерий - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – роды Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам + бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам-бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопргеидов и липополисахаридов. Грам-бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам + отличаются от грам - не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам + видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам -бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам + в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окрасить мазок генциан-виолетом (2 мин, через фильтровальную бумагу);

Бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин);

Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (на 30-40 с осторожно покачивая стеклом);

Тщательно смыть спирт водой;

Окрасить водным фуксином 2 мин);

Промыть водой и высушить при помощи фильтровальной бумаги.

Мазок поместить на предметный столик микроскопа, нанести в центр каплю иммерсионного масла, промикроскопировать. Зарисовать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свободной воды, а так же высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из за малой проницаемости оболочки. Проницаемость оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раствора краски с подогревом.

Техника окраски спор по методу Ожешко.

Нанести несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин);

Слить кислоту, промыть водой, высушить;

Зафиксировать в пламени;

Окрасить по методу Циля-Нельсена (при этом споры окрашиваются красный цвет, а вегетативные формы – в синий).

Техника окраски по методу Циля-Нельсена.

Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой и подогреть до появления паров (3-5 мин);

Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% раствором серной кислоты и 3% раствором солянокислого спирта (2-4 с);

Тщательно промыть водой;

Окрасить синькой Леффлера (3-5 мин);

Промыть водой и высушить споры.

Кислотоустойчивые бактерии, в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а все остальные – синими.

2. Приготовить мазок по методу Бурри-Гинса, промикроскопировать, зарисовать.

Многие виды микроорганизмов обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Техника обнаружения капсул по методу Бурри-Гинса.

Приготовить тушевой препарат по Бурри (смешать каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем приготовить мазок, как мазок из крови), затем высушить и зафиксировать (налить на поверхность мазка 96% спирт и поджечь);

Окрасить препарат водным фуксином (1-2 мин);

Промыть препарат водой, высушить на воздухе и микроскопировать.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы выявляются на черно-розовом фоне.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии.

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их формы, подвижности и т.д.

3. Изучить нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска.

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют его.

Техника метода «раздавленной капли».

На середину предметного стекла нанести петлей каплю исследуемого материала, накрыть ее покровным стеклом;

Рассмотреть в микроскопе с темным полем зрения, с объективом х40.

Техника метода «висячей капли».

Каплю исследуемого материала нанести на середину покровного стекла;

Быстро повернуть его каплей вниз и наложить на предметное стекло с углублением («лункой») в середине, причем капля должна свисать в углубление, не соприкасаясь с дном и краями;

Промикроскопировать.

Вопросы для обсуждения.

1. Постоянные и непостоянные структурные элементы микробной клетки. 2. Внутренние и поверхностные структурные элементы микробной клетки. 3. Строение и функции постоянных структурных элементов (нуклеоид, цитоплазма, цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, мезосомы, рибосомы). 4. Дифференциация бактерий с помощью окраски по Граму. 5. Особенности строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 6. Техника окраски микробов по Граму. 7. Отличительные признаки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. 8. Строение и функции непостоянных структурных элементов бактериальной клетки (капсула, споры, жгутики, включения, ворсинки). 9. Методы выявления непостоянных структурных элементов микробов: Шеффера-Фултона, Ожешко, Циля-Нильсена, Бури-Гинса, Нейссера. 10. Характеристика методов исследования микроорганизмов в живом состоянии. 11. Этапы методов «висячей» и «раздавленной» капли.